Quatrième volet sur DS, Professeur Layton et l'Appel du Spectre se présente comme un prologue à la série puisque les événements se déroulent 3 ans avant l'Etrange Village. Le professeur Layton et Luke ne se connaissent pas encore et on assiste donc à leur première rencontre dans cet épisode où un spectre contrôlé par une flûte tente de dévaster la cité de Mishallery.